在这些化合物中，我们进一步评估了最有效的 HDAC3 抑制剂 (4i) 相对于其他 I 类和 II 类 HDAC 亚型的 HDAC3 选择性。有趣的是，化合物 4i 对 HDAC3 (IC50 = 14 nM) 表现出最大的抑制效力，其选择性至少比 HDAC1 (IC50 = 1983 nM) 和 HDAC2 (IC50 = 1696 nM) 低 121 倍，而不会影响其他 HDAC，例如HDAC8 (IC50 = 10,744 nM)、HDAC6 (IC50 = 25,930 nM)、HDAC4 (IC50 > 20,000 nM) 和 HDAC5 (IC50 > 20,000 nM)。还值得注意的是，化合物 4i 的 HDAC3 抑制效力至少是参考 HDAC3 抑制剂的 17.5 倍，即 UF010 (IC50 = 256.7 nM)、(69) BG-45 (IC50 = 566 nM)、(76 ) 和 PT3 (IC50 = 245 nM)。 (75) 4i、BG-45、UF010和PT3的IC50值分析得到的剂量反应曲线如图S4所示，值列于表1中。总而言之，该系列吡嗪酰肼与其他测试的 HDAC 亚型相比，在吡嗪部分的对位胺上连接有各种帽基的化合物已证明对 HDAC3 的选择性和效力有所增加。

第一步，对所有合成化合物（3f-o、4f-o）进行小通量终点测定，以检测 5 μM 浓度下的泛 HDAC 抑制活性（HeLa 核提取物）（图 S1）和根据给定方案，1 μM 浓度下的 HDAC3 抑制活性（图 S2）。 (69) 有趣的是，与泛 HDAC 抑制（% 抑制）相比，所有这些化合物都提供了更好的 HDAC3 抑制（% 抑制），并且所有这些化合物（化合物 3f 除外）都产生了更好的 HDAC3 抑制（抑制活性范围） = 59.61–99.48%) 比 1 μM 的 UF010 低。因此，表明所有这些化合物均表现出比泛 HDAC 抑制更有效且选择性的 HDAC3 抑制模式。其中，化合物4g、3h、4h、3i、4i、4n和4o产生超过75%的HDAC3抑制。通过进一步筛选所选化合物在 1 μM 浓度下对 HDAC1 和 HDAC2 的抑制作用（图 S3A、B 和表 S1），我们注意到化合物 4h、4i、4n 和 4o 对 HDAC1 和 HDAC2 的抑制率低于 17%。 HDAC2 抑制。随后，我们还测定了这些化合物相对于 HDAC4、HDAC5、HDAC6 和 HDAC8 的抑制百分比值（图 S3C-F）。从所获得的化合物的％HDAC3抑制活性结果推断，具有各种帽基的化合物比没有连接帽基的化合物表现出更好的抑制效力（3f和4f）。此外，在以正丙基酰肼基团作为 ZBG 的帽区中含有苄胺 (4h)、对甲氧基苄胺 (4i)、5-吲哚基 (4n) 和 6-喹啉酰基 (4o) 的化合物表现出更好的功效HDAC3 高于 HDAC1 和 HDAC2 亚型，高于其余化合物。

在本文中，我们讨论并报道了一个由 20 个分子组成的小型文库的设计、合成和生物学评估，其中吡嗪酰肼支架在帽区具有不同的修饰，并且正丁基或正丙基酰肼作为 ZBG 。在本系列中，吡嗪因其更接近药物的性质和蛋白质相互作用的高潜力而被作为连接支架。 (70) 我们进行了体外生化 HDAC 酶抑制测定，以评估其 HDAC 亚型抑制效力和选择性。此外，还测试了所有这些化合物针对各种亚型乳腺癌细胞系的体外细胞毒性分析，并研究了它们相对于正常人类细胞系的选择性。然后对鉴定出的先导化合物 4i 进行详细的体外和体内生物学评估。此外，还在体外研究了化合物 4i 在化疗（奥沙利铂）耐药 MDA-MB-231 细胞中的化学增敏特性。再次使用大鼠肝微粒体对化合物 4i 进行体外代谢稳定性评估以及体内药代动力学分析。最后，还在 4T1-Luc 荷瘤小鼠模型中评估了化合物 4i 的体内抗肿瘤功效，随后对肿瘤组织进行了严格的机制和免疫组织化学分析。

已报道的 HDACis 的一般药效结构由帽区、连接区和锌结合基团 (ZBG) 组成。 (51) 根据结合在 HDAC 酶活性催化位点的 ZBG 的化学基序，HDAC 被分为四大类：异羟肟酸盐、苯甲酰胺、环四肽和短链脂肪酸，但最近，有几种其他 ZBG 已被鉴定，如苯酚、硫醇、酰肼等。 (52−57) 大多数以异羟肟酸盐作为 ZBG 的 HDACis 是泛 HDACis，具有一些脱靶效应和较差的生物利用度。 (58) 另一方面，以苯甲酰胺作为 ZBG 的 HDAC 被广泛报道为具有一定特异性的 HDAC，并且其中许多已在临床前进行了研究。不幸的是，迄今为止，除了西达本胺外，其他药物都尚未进入临床，这可能是由于它们的药代动力学特征和心脏毒性较差。 (59−62) 因此，鉴定具有强效抑制活性的高度特异性 HDAC 的需求尚未得到满足，从而提高生物利用度和代谢稳定性，特别是对于实体瘤的治疗。在这个方向上，最近，以酰肼作为 ZBG 的 HDACis 被报道为新一代 HDACis，具有高特异性和效力，以及改善的药代动力学特征和体内抗肿瘤效力，产生较少的脱靶效应。 (63−68) 我们的小组最近报道了一种有前途的 HDAC3 抑制剂 4e，以酰肼作为 ZBG，具有纳摩尔水平的 HDAC3 抑制活性 (HDAC3 IC50 = 15.41 nM)，并在 4T1-Luc 肿瘤体内显示出显着的抗肿瘤效力-轴承鼠标模型。 (69) 有了这些令人鼓舞的结果，我们建议对所报道的先导分子的帽和连接子区域进行修饰可能会提高 HDAC3 的选择性和效力，并改善可成药特性。随着HDAC3在乳腺癌中的作用得到确定，并且其在TNBC中的表达水平较高，更特异性的HDAC3抑制可以为乳腺癌，特别是TNBC提供更好的靶向治疗。 (3,4,21)

HDAC3 是 I 类 HDAC 亚型，众所周知参与乳腺癌发展的各个阶段。 HDAC3 过度表达导致疾病进展的各个阶段，例如增殖、凋亡、血管生成、细胞周期调节和转移。 (3) 特别是在 TNBC 中，HDAC3 表达水平高于非 TNBC。 (4,39,40) 文献报告证实了 HDAC3 在多种途径中的关键作用，其中 HDAC3 选择性抑制或敲低导致 p53 乙酰化表达上调并增强 p21 mRNA 水平，导致细胞周期停滞并最终导致细胞凋亡。 (41,42) 研究发现，HDAC3 表达通过 Akt/GSK3β 途径增加 β-连环蛋白表达，从而与癌症干细胞稳态相关。 (43) 使用 siRNA 抑制或敲除 HDAC3 会导致 ERα（雌激素受体 α）mRNA 蛋白水平和稳定性降低，从而导致乳腺癌细胞增殖减少。 (44,45) 许多其他最近使用 HDAC3 选择性抑制剂的报告已经确立了 HDAC3 在乳腺癌体外和体内模型中的关键作用。 (3,40,42,46−49) HDAC3的结构和调控机制已得到充分证实，因此，选择性HDAC3抑制剂的发现和开发已成为针对各种癌症最有前途的治疗策略。 (50)

由于 TNBC 治疗的针对性治疗干预措施有限，最常见的是化疗，因此随着时间的推移，TNBC 患者化疗耐药的发生率会更高。 (4,21,26) TNBC 中化学耐药性的不同机制 (26−29) 包括： (a) 由外排转运蛋白（例如包括 P-糖蛋白 (P-gp) 的 ABC 转运蛋白）引起的多药耐药性、多药耐药性-相关蛋白（MRP1）和乳腺癌抗性蛋白（BCRP）； (b) 与癌细胞存活、生长和侵袭有关的信号通路，例如 PTEN/PI3K/Akt/mTOR (PAM)、JAK/STAT、NF-κB 和 TGF-β； (c) 失调的 micro-RNA，例如导致转移和化疗耐药的 miR-221/222、miR-873、miR-770 和 miR-342-3p； (d) 引起癌症干细胞自我更新的途径，例如 Wnt/Frizzled/β-catenin、Hippo、Notch 和 Hedgehog 途径。 HDACis，如曲古抑菌素 A (TSA)、(30) 伏立诺他 (SAHA)、(31) 贝利诺他、(32) 和 CG200745 (33) 被发现可通过绕过或调节外排转运蛋白机制，使耐药癌细胞对常规化疗敏感。 ABC 转运蛋白、BCRP、MRP1，也通过癌症干细胞重编程。 (34−38) 因此，克服化疗耐药性的靶向治疗可能为精准医疗提供更好的机会，从而为乳腺癌患者提供更好的治疗。

HDAC 对赖氨酸残基的脱乙酰化导致基因表达（例如肿瘤抑制基因）的抑制，因此已知它们的过度表达与不同类型的癌症及其病因学相关。 (7) 因此，靶向 HDAC 在癌症治疗中得到了广泛的探索，在这个方向上，在过去的二十年中已经报道了几种组蛋白脱乙酰酶抑制剂 (HDACis)。 (9−18) 迄今为止，已鉴定出 18 种哺乳动物 HDAC 亚型，并将其分为四类，即 I 类 HDAC（HDAC1–3 和 HDAC8）、II 类 HDAC（HDAC4–7、HDAC9 和 HDAC10） )、III 类 HDAC (Sirtuins) 和 IV 类 HDAC (HDAC11)。 (19) 迄今为止，四种 HDACis（伏立诺他、贝利司他、罗米地辛和西达本胺）已被临床批准用于治疗特定的血液癌症。 (20) 此外，其他几种小分子 HDAC 正在探索用于治疗各种血液恶性肿瘤以及实体瘤。 (14,21−24) 已知所报道的 HDACis 在血液肿瘤中的临床疗效有限，并且在实体瘤中的表现也很差，因为没有临床批准的 HDACis 用于治疗实体瘤。 (20,25) 现有 HDACis 在乳腺癌和结直肠癌等实体瘤中的主要局限性可能是药代动力学较差且分子代谢稳定性较差。 (3,21,23,24) 此外，由于 HDAC 对不同 HDAC 亚型的非特异性，HDACis 治疗通常可能会导致多种不良反应和剂量相关的毒性。因此，识别和开发具有改善的代谢稳定性和药代动力学特征的异构体选择性 HDAC 一直是表观遗传药物发现领域研究人员的主要目标。

导致基因表达改变的表观遗传变化被认为是癌症发生和进展的最重要原因之一。 (5)针对这些表观遗传修饰是癌症治疗的重要策略之一。 (6) 在几种翻译后修饰中，组蛋白乙酰化的报道最为广泛。 (7)组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)两种不同的酶分别催化组蛋白N末端赖氨酸残基的乙酰化和脱乙酰化过程，从而调节基因表达。已知 HDAC 参与组蛋白和非组蛋白的翻译后修饰，因此在各种细胞和机制途径中发挥着至关重要的作用。 (8)

乳腺癌是最常见的癌症之一，在全球女性癌症相关死亡中排名第二。 (1,2) 乳腺癌是一种异质性疾病，由遗传和表观遗传变化引起。 (1)根据基因表达谱和分子特征，乳腺癌可分为四个亚型，即Luminal A（雌激素受体（ER）/孕激素受体（PR）阳性和人表皮生长因子受体2阴性） ；ER+、PR+、HER2−)、Luminal B（ER+、PR+、HER2+）、人表皮生长因子受体 2 阳性（HER2+）和三阴性乳腺癌（TNBC）（ER–、PR–、HER2−） 。 (3)其中，TNBC约占所有乳腺癌类型的15%，其特点是预后差、转移率高、复发风险高，导致总体生存率较低。 (4)

HDAC3 调节显示出治疗乳腺癌（包括三阴性病例）的希望。设计并合成了新型吡嗪酰肼基 HDAC3 抑制剂。先导化合物 4i 表现出有效的 HDAC3 抑制作用 (IC50 = 14 nM)，选择性至少为 121 倍。它对三阴性乳腺癌细胞表现出强大的细胞毒性（IC50：4T1 为 0.55 μM，MDA-MB-231 为 0.74 μM），而正常细胞毒性最小。代谢稳定的 4i 显示出优异的药代动力学特征。在荷瘤小鼠模型中观察到 4i 的剂量依赖性治疗效果。肿瘤组织的生物标志物分析显示，与 Ac-tubulin 和 Ac-SMC3 相比，Ac-H3K9、Ac-H3K27 和 Ac-H4K12 上的乙酰化增强，表明体内 4i 的 HDAC3 选择性。肿瘤组织的免疫印迹研究显示凋亡蛋白 caspase-3、caspase-7 和细胞色素 c 上调，而增殖标志物 Bcl-2、CD44、EGFR 和 Ki-67 下调。化合物 4i 是乳腺癌靶向治疗的有希望的候选药物，特别是对于三阴性乳腺癌病例。

选择性 HDAC3 抑制剂对三阴性乳腺癌具有强大的体内抗肿瘤功效

在这项工作中，使用基于片段的设计策略设计和合成了作为微管蛋白聚合抑制剂的新型香豆素基衍生物。代表性化合物 I-3 (MY-1442) 对 MGC-803、HCT-116 和 KYSE30 细胞表现出最有效的抗增殖活性，IC50 值分别为 0.034、0.081 和 0.19 μM。进一步研究发现，化合物I-3（MY-1442）可以直接与β-微管蛋白的秋水仙碱结合位点结合，抑制微管蛋白聚合，从而在细胞水平上抑制微管。分子对接分析表明，化合物 I-3 (MY-1442) 可以通过疏水相互作用和氢键与微管蛋白良好结合。通过对微管蛋白聚合能力的抑制作用，化合物I-3（MY-1442）对胃癌细胞MGC-803表现出有效的抗增殖、促凋亡和抗迁移能力。化合物I-3（MY-1442）的体内抗肿瘤活性结果表明，其具有很强的体内肿瘤抑制作用，30 mg/kg/天的TGI率为65.5%。因此，香豆素骨架有可能成为微管蛋白聚合抑制剂的核心，具有开发抗癌药物的巨大潜力。

在第三轮优化中，我们进一步探索了以香豆素为核心连接哌嗪、哌啶、吡咯烷酮或吗啉的N-1位的抑制作用化合物I-13∼I-18，探讨其对抑制效果的影响。去除 1,2,3,4-四氢喹啉和二氢吲哚中的芳基（表 3）。不幸的是，大多数这些化合物表现出较差的抗增殖活性，48 小时 IC50 值 > 20 μM。

在第二轮优化中，我们进一步探索了化合物I-9∼I-12的抑制作用，其香豆素核心通过羰基连接到1,2,3,4-四氢喹啉或二氢吲哚的N-1位上。链接器（表 2）。不幸的是，这些化合物表现出明显降低的抗增殖活性，48 h IC50 值范围为 5.01 至 8.16 μM，弱于化合物 I-1∼I-8，表明香豆素核心和 1 的 N-1 位之间的正确连接体,2,3,4-四氢喹啉和二氢吲哚有助于保留抑制效力。

如表1所示，我们首先探讨了香豆素核心直接连接到1,2,3,4-四氢喹啉或二氢吲哚的N-1位的化合物I-1∼I-18的抗增殖活性。正如预期的那样，大多数化合物对这三种癌细胞表现出强效至中度的抗增殖活性，48 个 IC50 值介于 0.034 至 2.89 μM 之间。其中，带有6-甲氧基-1,2,3,4-四氢喹啉基团的化合物I-3（MY-1442）对MGC-803（IC50=0.034μM）、HCT-116（IC50）表现出最强的抑制活性。 = 0.081 μM）和 KYSE30（IC50 = 0.19 μM）细胞，这也与报道的基于 6-甲氧基-1,3,4-四氢喹啉的微管蛋白抑制剂一致。此外，MGC-803 细胞对大多数化合物 I-1∼I-8 更敏感，IC50 值较低，48 且化合物 I-3 (MY-1442) 对 MGC-803 细胞表现出比阳性细胞更有效的抑制活性。控制秋水仙碱。与化合物I-1相比，发现1,2,3,4-四氢喹啉的取代基对抑制效力有一定的增强作用。在化合物I-2～I-4中，给电子基团（-CH3和-OCH3）的引入有助于增强活性，而吸电子基团（-OH和-Cl）的引入削弱了对MGC-的抑制能力。 803 个细胞。此外，用二氢吲哚取代 1,2,3,4-四氢喹啉基团明显降低了对 MGC-803 细胞的抑制作用（化合物 I-6 与 I-1、I-7 与 I-3 和 I-8 与I-2）。类似地，带有 5-甲氧基二氢吲哚基团的化合物 I-7 对 MGC-803 细胞表现出比化合物 I-6 和 I-8 更有效的抑制活性。

考虑到香豆素衍生物被设计为抗癌药物，因此采用MTT法来探讨其对MGC-803（人胃癌细胞）、HCT-116（人胃癌细胞）和KYSE30（人食管癌细胞）细胞的抗增殖活性。另外，选择著名的微管蛋白聚合抑制剂秋水仙碱和化合物6作为阳性对照。化合物I-1～I-18的抗增殖活性结果如表1～3所示。

为了延续我们对开发新型 CBSI 的兴趣，我们设计并合成了一系列新型香豆素基衍生物作为微管蛋白聚合抑制剂。此外，1,2,3,4-四氢喹啉基和二氢吲哚基衍生物[[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]]（例如化合物7 [ 31]和8 [34]）已被发现作为新型CBSI，在低纳摩尔水平下具有有效的抗增殖作用。在这项工作中，我们假设通过分子杂交策略的原理将1,2,3,4-四氢喹啉或二氢吲哚片段连接到香豆素核心可以提供新型香豆素基衍生物，该衍生物也可能与β的秋水仙碱结合位点结合-微管蛋白具有有效抑制微管蛋白聚合和癌细胞的活性。在FDA批准上市的药物中，含氮杂环化合物，尤其是哌嗪，经常被用作重要的官能团[[37]、[38]、[39]]。为了更好的构效关系研究，还设计并合成了含有哌嗪、哌啶、吡咯烷酮或吗啉的香豆素衍生物。其中，代表性的香豆素-1,2,3,4-四氢喹啉I-3（MY-1442）被鉴定为秋水仙碱结合位点抑制剂，对微管蛋白聚合和癌细胞具有有效的抑制作用（图2）。

2H-chromen-2-one（香豆素）作为一种有前途的支架，经常用于新型抗癌药物的开发[20]。人们发现许多基于香豆素的衍生物通过作用于秋水仙碱结合位点而表现出有效的抗癌作用[[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]]。据报道，4-芳基香豆素类似物 1 是一种有效的 CBSI，对 HBL100、K562 和 HCT-116 细胞具有有效的细胞毒性 [25]。陈等人。据报道，4-取代香豆素 2 [26] 和 3 [27] 是高效的 CBSI，在体外和体内抑制 A2780S 和 A2780/T 细胞的生长具有有效的抗癌功效。我们课题组一直关注香豆素类抗癌药物的发现[[28]、[29]、[30]]，我们还报道了香豆素类衍生物4[28]、5[29]和6[ 30]作为具有良好抗肿瘤活性的CBSI。三甲氧基苯基-香豆素杂合体 4 有效抑制 MGC-803、PC-3 和 HepG2 细胞的生长，IC50 值为 0.13–1.74 μM，并通过与秋水仙碱位点结合强烈抑制微管蛋白的聚合。香豆素-吲哚 5 和香豆素-二氢喹喔酮 6 对微管蛋白聚合具有显着的抑制作用，并对 MGC-803 细胞具有有效的抗增殖活性（IC50 值分别为 11.0 和 11.7 nM），并且在 MGC-803 中具有体内抗癌功效异种移植肿瘤模型（图1）。

微管在各种生物学功能中发挥着至关重要的作用，并已成为人类癌症治疗的重要且成功的靶标[[1]、[2]、[3]]。一些针对微管的小分子抑制剂（如紫杉烷、长春花生物碱）已成功获得FDA批准用于癌症治疗，市场表现显着。目前，总共已鉴定出7个微管蛋白结合位点，一些针对紫杉烷或长春花生物碱结合位点的微管抑制剂已被美国FDA批准用于临床癌症治疗[[4],[5],[6]]。秋水仙碱结合位点作为微管蛋白结合位点之一，也受到高度重视，因为它可以在一定程度上克服紫杉烷或长春花生物碱结合位点的缺点和限制[[7]、[8]、[9]]。 CBSI（秋水仙碱结合位点抑制剂）通常具有多种化学结构类型，具有显着的抗癌功效[[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17] ]，[18]]，其中一些（例如 CA-4P、AVE8062 和 BCN-105P）已经或正在癌症治疗的临床试验中进行研究[19]。

在这项工作中，设计并合成了一系列新型香豆素衍生物作为针对秋水仙碱结合位点的微管蛋白聚合抑制剂，并评估了它们对 MGC-803、HCT-116 和 KYSE30 细胞的抗增殖活性。其中，带有6-甲氧基-1,2,3,4-四氢喹啉基团的化合物I-3（MY-1442）对MGC-803（IC50=0.034μM）、HCT-116（IC50）表现出最强的抑制活性。 = 0.081 μM）和 KYSE30 细胞（IC50 = 0.19 μM）。进一步的机制研究表明，化合物I-3（MY-1442）可以直接与β-微管蛋白的秋水仙碱结合位点结合，从而在细胞水平上抑制微管蛋白聚合和微管。分子对接结果表明化合物I-3（MY-1442）与β-微管蛋白秋水仙碱结合位点之间存在良好的结合相互作用。化合物 I-3 (MY-1442) 还对胃癌细胞 MGC-803 表现出有效的抗增殖、促凋亡和抗迁移能力。此外，化合物 I-3 (MY-1442) 可以调节细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。重要的是，化合物 I-3 (MY-1442) 可以显着抑制 MGC-803 异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长，30 mg/kg/天的 TGI 率为 65.5%。总而言之，这项工作表明香豆素骨架具有作为微管蛋白聚合抑制剂的关键药效​​团的巨大潜力，可用于发现抗癌药物。

发现新型香豆素衍生物作为微管蛋白聚合抑制剂，靶向秋水仙碱结合位点，具有有效的抗胃癌活性

CDK9 与 Cyclin T1 结合，是任何细胞中 RNA 聚合酶 II 介导的关键基因高效转录的主要调节因子之一。 CDK9 的活性在多种癌症实体中显着上调，以帮助负责调节功能的基因过度表达，这对癌细胞有益，如增殖、存活、细胞周期调节、DNA 损伤修复和转移。因此，增强的 CDK9 活性会导致许多癌症类型的预后较差，这为使用小分子抑制剂靶向它提供了理由。已经开发出几种特异性越来越强的抑制剂，其中一些目前正在进行临床试验。其他正在测试的方法包括将针对 CDK9 活性的抑制剂与针对 CDK9 上游调节因子（如 BRD4、SEC 和 HSP90）的抑制剂相结合；或下游效应子，如 cMYC 和 MCL-1。 CDK9 活性的抑制有可能成为一种高效的抗癌疗法。

靶向 CDK9 的抗癌治疗