Tarea de hurgar en la nariz. Los ratones se colocaron en una caja operante equipada con dos ranuras para pinchar la nariz en lugares simétricos de una de las paredes de la jaula. Los pinchazos en la nariz estaban conectados a un dispositivo de detección de rayos fotoeléctricos que permitía medir las respuestas con una resolución de 10 ms, y sólo uno de ellos activaba el láser (estimulación constante de 1 s). El lado activo fue contrabalanceado entre los animales y las respuestas detectadas mientras el láser estaba encendido no tenían consecuencias programadas. Se realizaron dos días consecutivos de sesiones de estimulación y al tercer día se realizó una prueba de extinción (lo que significa que ambos pinchazos de nariz estaban inactivos). Todas las marcas de tiempo de las respuestas se guardaron en un archivo informático para su posterior análisis. Todas las sesiones experimentales tuvieron una duración de 30 minutos. La relación de preferencia se calculó de la siguiente manera

where n denotes the detected number of responses for the corresponding side during a given session.

Aversión condicionada al sabor. En la primera sesión, los ratones D1-Cre fueron expuestos durante 30 minutos a un nuevo degustador (el edulcorante artificial Rebaudioside A) y 15 minutos después de finalizar la sesión los animales recibieron una inyección intraperitoneal del agente inductor de malestar cloruro de litio (0,35 M, 10 μl por g de peso corporal). Al día siguiente, se probó la aversión condicionada. Durante esta sesión de 30 minutos, todos los grupos recibieron un pulso de luz de 1 s por cada 20 lamidos producidos. Los lametones detectados mientras el láser estaba encendido no tenían consecuencias programadas. Todas las estimulaciones se realizaron de forma bilateral.

Antes de obtener la prueba conductual final, los animales fueron habituados a las cajas conductuales y a las condiciones experimentales durante cinco sesiones diarias de 1 hora.

Los animales utilizados para las mediciones de dopamina extracelular fueron entrenados para beber sucralosa mientras recibían una infusión intragástrica de sucralosa. La parte exterior de la sonda gástrica se conectó a un segmento de tubo de MicroRenathane fijado a la punta de una jeringa estándar de 3 ml que contenía las soluciones a infundir y que estaba montada en la bomba de jeringa. La bomba de jeringa se colocó cerca de un pequeño orificio hecho en la parte superior de la caja de atenuación del sonido, de manera que los ratones pudieran moverse libremente dentro de las cámaras de comportamiento. Durante la tarea, un lametón detectado desencadenaba una infusión intragástrica que duraba 3 s (a una velocidad de 0,6 ml min-1, 30 μl por infusión). Los lametones detectados mientras se realizaba la infusión no tenían consecuencias programadas. Para acostumbrar a los animales a la configuración de la microdiálisis, durante estas sesiones los ratones también estaban conectados a sondas de microdiálisis ficticias. Todas las sesiones duraron 1 h. Durante la sesión experimental, la solución de bebida y el contenido de la jeringa se cambiaron según las diferentes condiciones experimentales.

Los ratones expuestos a las infusiones intragástricas desencadenadas por el amargor fueron expuestos a estas condiciones experimentales durante tres sesiones diarias antes de realizar las mediciones de dopamina (número de lamidas en cada caso: día de habituación 1: 160 ± 22, día de habituación 2: 162 ± 13, día de microdiálisis VS o DS (es decir, día 3 o 4, contrabalanceado): 118 ± 14 o 131 ± 23, ANOVA de medidas repetidas de una vía a través de los días de prueba F[3,15] = 0,92, P = 0,45. Todas las pruebas t emparejadas que incluían el número de lametones durante la microdiálisis frente a la habituación P > 0,25). Las soluciones amargas nunca estuvieron presentes en ninguno de los infusorios intragástricos en ninguna condición, sólo en las soluciones disponibles para lamer.

Los animales utilizados para los experimentos optogenéticos fueron entrenados primero para beber 2 mM de sucralosa mientras estaban conectados a las fibras ópticas pero sin recibir pulsos de luz azul, y posteriormente se cambiaron las soluciones para beber y la estimulación lumínica según las diferentes condiciones experimentales. Para acoplar el consumo a la activación del láser, los lametones detectados activaron una fuente de láser azul de 473 nm a través de pulsos TTL, tal y como se ha descrito anteriormente para las infusiones intragástricas. La intensidad en la punta de las fibras se estimó en aproximadamente 5 mW. Se utilizaron pulsos constantes de luz para la estimulación de D1 con una duración de 0,5 s, mientras que para la estimulación del pálido ventral y la subtantia nigra reticulata se utilizaron pulsos de 10 Hz con una duración de 1 s. Las lamidas detectadas mientras el láser estaba encendido no tuvieron consecuencias programadas. En los experimentos de estimulación D1 en los que el lamido se acopló a infusiones intragástricas, la duración de los pulsos de luz fue la misma que la de las infusiones (pulsos de luz constantes de 3 s de duración). Todas las estimulaciones se realizaron de forma bilateral.

Se utilizaron los siguientes estímulos gustativos, tal como se indica en los experimentos correspondientes: Sucralosa 2 mM, una mezcla de benzoato de denatonio 3 mM y sucralosa 2 mM (mezcla dulce/amarga) y Rebaudiósido A 3 mM. Para los experimentos de infusión intragástrica acoplada a la ingesta oral se utilizaron sucralosa 2 mM y soluciones de L y D-glucosa a una concentración del 50% (p/vol). Todos los reactivos se obtuvieron de Sigma-Aldrich y se prepararon frescos en agua destilada.

Los experimentos de alimentación y lamido se llevaron a cabo en una de las tres cámaras de comportamiento de ratón idénticas encerradas en un cubículo ventilado y con atenuación de sonido (Med Associates). Cada cámara estaba equipada con una ranura para la colocación de tubos para sorber situada en el centro de una de las paredes y oculta por una puerta controlada por software, que se abría al principio de las sesiones. A partir de ese momento el lamido era voluntario y los animales podían iniciar o interrumpir el lamido ad libitum. El sipper estaba conectado a un dispositivo de detección de lamidos por contacto que permitía medir las respuestas de lamido con una resolución de 10 ms. Todas las marcas de tiempo de los lametones se guardaron en un archivo informático para su posterior análisis. Los láseres controlados por software y las bombas de infusión equipadas con dispositivos de entrada TTL se conectaron a las cámaras de comportamiento y se programaron para activar automáticamente el láser y/o las infusiones en respuesta a la detección de los lametones. Se utilizó MED-PC IV (Med Associates) como plataforma para programar todos los experimentos.

Stereotaxic viral injections and electrode array implantation. Drd1a-cre mice were used for the extracellular recording experiments, anesthesia was induced with intraperitoneal injection of a ketamine/xylazine (100/15 mg kg−1), a small incision was made into the abdominal muscle and 3 cm of MicroRenathane tubing was inserted into the intraperitoneal cavity. The purse string was tightened around the tubing, which was then tunneled subcutaneously to the dorsum via a small hole made between the shoulder plates to allow for catheter exteriorization. Immediately after, the mouse was placed on a stereotaxic apparatus (David Kopf) under constant flow of ∼1% isoflurane anesthesia (1.5 l min−1) for viral injections and electrode implantation. AAV-hSyn-HA-hM3D(Gq)-IRES-mCitrine virus was then injected either in substantia nigra compacta or ventral pallidum. The procedure for the virus injection was the same as described before. Once the virus injection was completed, an electrode array consisting of 16 tungsten microwires (35-μm diameter) targeting substantia nigra compacta or ventral pallidum was implanted. Locations of electrodes were confirmed histologically.

Inyecciones virales estereotáxicas e implantación de fibras ópticas Para los animales utilizados en los experimentos de optogenética, se indujo la anestesia con una inyección intraperitoneal de una ketamina/xilazina (100/15 mg kg-1) y se colocó al ratón en un aparato estereotáxico (David Kopf) bajo un flujo constante de anestesia de ∼1% de isoflurano (1,5 l min-1). Todas las inyecciones virales se realizaron de forma bilateral, utilizando jeringas de microlitro modificadas (Hamilton) con una aguja de calibre 22. La punta de la aguja se colocó en las regiones objetivo y las inyecciones se realizaron a una velocidad de 0,1 μl min-1 (para las coordenadas y los volúmenes, véase más adelante). Una vez terminada la inyección, se dejó la aguja durante 10 minutos y luego se retiró lentamente. Inmediatamente después de la inyección viral se implantaron las fibras ópticas (núcleo de 200-μm, 0,22 NA, Doric Lenses). Para dar tiempo a la expresión viral, los animales fueron alojados durante al menos 2 semanas tras la inyección antes de iniciar cualquier experimento.

Se utilizaron ratones Drd1a- y Drd2-cre para las inyecciones en las regiones estriatales dorsales y ventrales. Las coordenadas utilizadas para el estriado dorsal fueron AP = 1,0 mm, ML = ±1,7 mm y DV = -3,0 mm (desde la superficie del cráneo) y se inyectó 1 μl de virus AAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP por hemisferio. Las coordenadas utilizadas para el estriado ventral fueron AP = 1,5 mm, ML = ±0,6 y DV = -4,5 mm (desde la superficie del cráneo) y se inyectaron 0,5 μl de los virus AAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP o AAV-EF1a-DIO-eArch3.0-EYFP por hemisferio.

Los ratones Ai32, que expresan una proteína de fusión canalrodopsina-2/EYFP tras la exposición a la recombinasa Cre, se utilizaron para la expresión de ChR2 en las regiones del pálido ventral y la sustancia negra pars reticulata. Las coordenadas utilizadas para el palidum ventral fueron AP = 0,7 mm, ML = ±1,0 y DV = -4,9 mm (desde la superficie del cráneo). Las coordenadas utilizadas para la sustancia negra reticulada fueron AP = -3,2 mm, ML = ±1,6 y DV = -4,4 mm (desde la superficie del cráneo). En ambos casos se inyectaron 0,5 μl de virus AAV-CMV-Cre por hemisferio.

Los ratones Drd1a-cre se utilizaron para los experimentos que implicaban la activación simultánea de las regiones estriatales (dorsal y ventral) y sus objetivos posteriores (substantia nigra pars reticulata y pallidum ventral, respectivamente). Se inyectó el virus AAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP en las regiones estriatales y el virus AAV-hSyn-HA-hM3D(Gq)-IRES-mCitrine en los objetivos posteriores. Las coordenadas y los volúmenes empleados fueron los mismos que los descritos anteriormente para las áreas correspondientes.

Ablación mediada por caspasas de células excitables por dopamina. Para lograr la ablación mediada por la caspasa de las neuronas excitables por la dopamina en el estriado, la construcción viral dependiente de Cre AAV-flex-taCasp3-TEVp (serotipo 5, Centro de Vectores de la Universidad de Carolina del Norte) se inyectó estereotaxialmente (0,5 μl por hemisferio) en el estriado dorsal o ventral de ratones D1r-Cre en las mismas coordenadas utilizadas para los experimentos optogenéticos. El grupo de control incluía ratones no-Cre transfectados con AAV-flex-taCasp3-TEVp. La especificidad celular de las ablaciones se confirmó mediante métodos de rastreo retrógrado neuroanatómico. El trazador retrógrado fluorescente Red Retrobeads (LumaFluor) se inyectó en la sustancia negra, pars reticulata (0,1 μl), el objetivo ipsilateral exclusivo de las neuronas que expresan D1r del estriado dorsal en un hemisferio, y en el globo pálido (0,1 μl), el objetivo ipsilateral exclusivo de las neuronas que expresan D2r del estriado dorsal, en el otro hemisferio. A continuación, se confirmó, mediante microscopía fluorescente, el fuerte etiquetado en todo el estriado dorsal en el mismo hemisferio en el que se inyectaron las perlas fluorescentes retrógradas en el globo pálido, y el etiquetado más débil en todo el estriado dorsal en el mismo hemisferio en el que se inyectaron las perlas fluorescentes retrógradas en la sustancia negra pars reticulata. Se realizaron inyecciones equivalentes de Retrobead en el palidum ventral, el objetivo preferente de las neuronas que expresan D1r en el estriado ventral. Para permitir la visualización de los puntos de referencia anatómicos relevantes, las imágenes muestran la señal de fluorescencia de Retrobead superpuesta a una imagen de campo claro de la misma sección.

Entrega viral de transgenes. Los virus adeno-asociados (AAVs, serotipo 5, Centro de Vectores de la Universidad de Carolina del Norte) portadores de genes de interés se obtuvieron de los Servicios del Centro de Vectores de la Universidad de Carolina del Norte. Todas las inyecciones fueron bilaterales en la estructura de interés. Para la transfección dependiente de Cre con el canal iónico sensible a la luz azul channelrhodopsin (ChR2), se utilizó la construcción AAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP. Para la transfección dependiente de Cre con una arqueodopsina sensible a la luz verde (eArch3.0), se utilizó la construcción AAV-EF1a-DIO-eArch3.0-EYFP. Para la combinación con la estimulación quimiogenética (DREADDs), se inyectó también AAV-hSyn-HA-hM3D(Gq)-IRES-mCitrina en el sitio correspondiente y se activaron los receptores mediante CNO a 1 mg kg-1 intraperitoneal. Los animales de control eran de la cepa correspondiente, transfectados con un canal iónico dependiente de Cre insensible a la luz (AAV-hSyn-DIO-HA-hM3D(Gq)-IRES-mCitrine). Para la ablación mediada por la caspasa de las neuronas excitables por la dopamina en el estriado, se utilizó la construcción viral dependiente de Cre AAV-flex-taCasp3-TEVp. Todos los procedimientos, incluyendo la colocación de la fibra y la activación del láser, fueron idénticos para los ratones ChR2+ y ChR2-.

Implantación de la sonda gástrica. Una vez anestesiados los animales con una inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (100/15 mg kg-1), se realizó una incisión en la línea media del abdomen. Se exteriorizó el estómago a través de la incisión de la línea media y se colocó una sutura en forma de bolsa en su región no glandular, en la que se insertó la punta de un tubo de MicroRenathane (Braintree Scientific). Se apretó el cordón alrededor del tubo, que se introdujo por vía subcutánea en el dorso a través de un pequeño orificio realizado en el músculo abdominal; a continuación se realizó una pequeña incisión en el dorso entre las placas de los hombros para permitir la exteriorización del catéter. Las incisiones se suturaron y se desinfectaron a fondo y se taponó el extremo exterior del catéter

Implantación de cánulas de guía de microdiálisis. Para los animales utilizados en los experimentos de microdiálisis, se indujo la anestesia con una inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (100/15 mg kg-1) y se colocó al ratón en un aparato estereotáxico (David Kopf) bajo un flujo constante de anestesia de ∼1% de isoflurano (1,5 l min-1). Para la región estriatal dorsal se perforó una craneotomía circular a AP = 1,0 mm y ML = ±1,7 mm de implantación de una cánula guía (DV = -2,0 mm desde la superficie del cráneo) para la inserción posterior de una sonda de microdiálisis cuya membrana de diálisis expuesta tenía 2 mm de altura; para la región estriatal ventral se perforó una craneotomía circular a AP = 1. 5 mm y ML = ±0,6 mm la implantación de una cánula guía (DV = -4,0 mm desde la superficie del cráneo) para la inserción posterior de una sonda de microdiálisis cuya membrana de diálisis expuesta era de 1 mm de altura.

Se utilizó un total de 170 ratones machos adultos, incluidos 74 ratones C57BL6/J de tipo salvaje, 68 ratones machos con receptor de dopamina Cre-recombinasa (Drd1a-cre+, cepa EY262, Gensat), 12 ratones con receptor de dopamina Cre-recombinasa D2 (B6. FVB(Cg)-Tg(Drd2-cre)ER44Gsat/Mmcd, Gensat) y 16 ratones Ai32 (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm32(CAG-COP4*H134R/EYFP)Hze/J, Jackson Laboratory). En el momento de los experimentos, los animales tenían entre 8 y 20 semanas de edad y no habían tenido experiencias previas con ninguna de las condiciones experimentales. Todos los animales fueron alojados en grupo (<4 jaulas) antes del comienzo de las sesiones experimentales. Tras la asignación aleatoria a un grupo experimental, todos los animales fueron alojados individualmente. Los animales fueron alojados bajo un ciclo de luz/oscuridad de 6 a.m./6 p.m.. Los experimentos se realizaron constantemente entre las 4 p.m. y las 12 a.m. para maximizar la motivación para el comportamiento de alimentación. Cada animal individual fue expuesto a un único grupo experimental. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las normas del Laboratorio J.B. Pierce y de la Universidad de Yale sobre el uso de animales en la investigación.